1. INTERÉS DEL ESTUDIO DEL ESTRÉS OXIDATIVO EN LA CLÍNICA

El estrés oxidativo se asocia al envejecimiento precoz o acelerado, a patologías inflamatorias, degenerativas, diabetes, dislipemias y algunos tipos de cáncer; a procesos vinculados al estilo de vida (obesidad, sedentarismo, hábitos tóxicos); a la actividad física de alto nivel. Actualmente se está relacionando directamente su incidencia en la capacidad de estimular de la expresión de polimorfismos genéticos directamente implicados con el desarrollo de patologías.

Las especies químicas oxidantes actúan extrayendo equivalentes reductores (electrones y átomos de hidrógeno) a la otra especie química o sustancia que sería el reductor. Las especies químicas oxidantes se clasifican en especies radicálicas y no radicálicas, siendo las radicálicas las denominadas radicales libres. Las no radicálicas presentan todos sus electrones apareados.

En función de la naturaleza del elemento que participa en la acción oxidante las especies químicas reactivas pueden ser de oxígeno (ROS), nitrógeno (RNS), carbono (RCS), sulfuro (RSS) y de halógenos (RAS) como el cloro.

Las especies químicas oxidantes son productos normales del metabolismo celular con papel relevante en la biología y bioquímica del organismo. Pero en determinadas ocasiones, su aumento puede atacar y dañar moléculas endógenas como lípidos, ácidos nucleicos y proteínas, llegando a provocas afectaciones sistémicas, y denominándose estrés oxidativo. Es importante aclarar que el estrés oxidativo puede deberse a especies radicalicas y no radicálicas, y centradas o no en el oxígeno.

Para contrarrestar el efecto dañino del exceso de especies químicas oxidantes, el organismo dispone de un sistema de defensa basado en moléculas antioxidantes endógenas de tipo enzimático y no enzimático, y exógenas.

La situación de estrés oxidativo se puede producir por exceso de especies reactivas oxidantes y por déficit de sistemas antioxidantes. Por ello puede definirse como un proceso patológico causado por la ruptura del equilibrio fisiológico entre la producción y eliminación de especies químicas oxidantes.

El aumento de producción puede ser debido a factores externos al organismo (agentes físicos, agentes químicos, agentes biológicos) y al aumento de factores internos del organismo por una estimulación excesiva de los sistemas enzimáticos oxidantes.

El descenso en las defensas antioxidantes puede relacionarse con un aporte reducido, un consumo aumentado, una baja biodisponibilidad o una deficiencia de los sistemas enzimáticos destinados a la inactivación de la espacies químicas oxidantes.

El estrés oxidativo se caracteriza por no presentar sintomatología propia, no dar lugar a un cuadro clínico peculiar pudiendo confundirse con los signos de la enfermedad de base. Por tanto solo puede ser diagnosticado mediante métodos de análisis específicos.

2. PRINCIPIOS SOBRE LA EVALUACIÓN DEL ESTRÉS OXIDATIVO

El estrés oxidativo establecido por el exceso de producción de especies químicas oxidantes o una eficiencia reducida de los sistemas de defensa antioxidante a nivel intra o extracelular, puede llevar a una excesiva oxidación de moléculas orgánicas y a un aumento de niveles de subproductos de oxidación que pueden acumularse en los líquidos extracelulares.

La evaluación del estrés oxidativo se ha desarrollado durante años a partir de técnicas analíticas de laboratorio, basadas principalmente en reacciones químicas. Sin embargo, en la última década ha prosperado el interés por técnicas electroquímicas basadas en los mecanismos redox como comportamiento bioeléctrico, y que resulta de fácil evaluación fuera de los centros o laboratorios de análisis.

3. TÉCNICAS ANALÍTICAS DE LABORATORIO

La primera aproximación analítica implica la medición directa de estos oxidantes en una muestra biológica. Dada su cortísima semivida solo pueden ser medidos por espectroscopía de espín de electrón (NMRS) o de resonancia magnética nuclear (ESR).

Dada la complejidad y difícil disponibilidad, se emplean métodos indirectos que se denominan como “finger printing”. Consiste en la medición de especies moleculares que resultan modificadas por el ataque de los radicales libres. Tras el ataque de las especies químicas oxidantes sobre las moléculas celulares, se generan subproductos que costituyen el finger printing o prueba del ataque oxidativo ocurrido, y se consideran marcadores del estado oxidante.

Algunos de estos marcadores pueden actuar también como como amplificadores del daño oxidativo, siendo muy importante su identificación para cuantificar la causa y efecto del estrés oxidativo.

A nivel tisular, y en particular hemático, la defensa antioxidante está garantizada por la barrera antioxidante plasmática según su potencial de oxidorreducción a la acción oxidante de especies reactivas. Es decir, la capacidad de sus constituyentes de ceder equivalentes reductores (electrones y atómos de hidrógeno) a las especies reactivas.

En esta barrera antioxidante plasmática participan moléculas exógenas (ascorbatos, tocoferoles, carotenoides, bioflavonoides, etc) y endógenas enzimáticas (GSH, catalasa, SOD) y no enzimáticas (proteínas, bilirrubina, ácido úrico, colesterol, etc), que ceden equivalentes reductores a las especies reactivas y previenen la producción de reacciones en cadena peligrosas. La valoración del estado antioxidante en un sistema biológico como la sangre es indicativo de una alteración del equilibrio oxidativo y puede señalar un proceso de estrés oxidativo por reducción de las defensas antioxidantes.

El marcador ideal del estrés oxidativo no ha sido todavía establecido. Se considera la importancia de evaluar tanto el componente prooxidante como el antioxidante. Y dentro de los análisis existentes se pueden encontrar métodos directos e indirectos, así como métodos globales y específicos.

Test para evaluar el estado oxidante

Métodos globales

Medición de hidroperóxidos. El nivel total de hidroperóxidos sirve para valorar el estado oxidante de una muestra de fluído biológico. Los métodos empleados en este sentido son:

  • d-ROMs. Es un método espectrofotométrico que mide la coloración producida por la oxidación de la N,N-dietilparafenilendiamina debida a los radicales alcoxilo e hidroperoxilo existentes en la muestra. El resultado se expresa en U CARR (unidades carrateli, nombre del inventor) donde 1 U CARR = 0,08 mg/dl de peróxido de hidrógeno.
  • TMB. En este se emplea la 3,3´,5,5´-tetrametilbenzidina, y se expresa en unidades HK el porcentaje de peróxido de hidrógeno en la solución estándar.
  • TOS (total oxidant status). Se basa en la capacidad de la muestra de suero de oxidar el hierro de ión ferroso a férrico y medir el ión férrico generado mediante naranja xilenol. El resultado se expresa en equivalentes de peróxido de hidrógeno.

Métodos específicos

  • Determinación de óxido nítrico y subproducto en el exhalado respiratorio.
  • Determinación de peróxido de hidrógeno en plasma mediante catalasa.

Métodos indirectos

Según el tipo de molécula que ha sufrido el daño se puede aplicar a hidratos de carbono, lípidos, aminoácidos, proteínas, nucleótidos, etc. Se evalúan metabólitos resultantes del daño oxidativo.

Algunos ejemplos son dienos conjugados, lipoperoxidos, isoprostanos, endoperoxidos (HNE, acroleína, MDA, pentano, etano), isoprostanos, LDL-Ox, carbonilos proteicos, aminoácidos hidroxilados, proteínas glicadas, nitración y desaminación de bases.

  • Medición de la actividad de leucocitos polimorfonucleares. Se realiza por quimioluminiscencia.
  • Medición de mieloperoxidasa. Enzima que se expresa en procesos inflamatorios de tipo oxidativo, y puede ser un indicador predictivo e indicativo de daño cardiovascular.

Test para evaluar la capacidad antioxidante

Métodos Globales

La barrera antioxidante plasmática garantiza la defensa ante especies oxidantes. Esta promovida por múltiples sustancias, tanto exógenas (ascorbato, tocoferoles, carotenoides, bioflavonoides) como endógenas no enzimáticas (proteínas, bilirrubina, ácido úrico, colesterol) y endógenas enzimáticas (glutatión, catalasa, superoxidodismutasa.

Esta barrera antioxidante cede reductores (electrones y átomos de hidrógeno) a las especies reactivas, para impedir que dañen otros compuestos esenciales. Esta agresión es lo que supone alteraciones del envejecimiento y las enfermedades realcionadas con el estrés oxidativo. La alteración en el equilibrio de defensas antioxidantes es indicativa de un proceso de estrés oxidativo.

Los Test FRAS, BAP, AOP, CUPRAC miden la capacidad de la muestra de reducir un metal de transición (Fe, Cu).
Los Test TAS, TRAP y OXY-adsorbent test miden la capacidad del plasma de inhibir la acción de un generador de oxidantes.

Cabe reseñar el Test ORAC por lo extendido que se encuentra en la tabulación de sustancias antioxidantes naturales, y la relación histórica que guarda con el método nuevo del que vamos a hablar más adelante. Es acrónimo de “Oxígen Radical Absorbance Capacity”, que mide la actividad neutralizadora de una muestra de suero/plasma sobre los radicales peroxílicos inducidos por el 2-amidino-propano, usando la beta-ficoeritrina como sonda fluorescente.

Métodos específicos

Relativos a moléculas de naturaleza proteica (albúmina, ferritina, transferrina, ceruloplasmina), no proteica (ácido úrico, bilirrubina), hormonal (colesterol, melatonina), vitamínica (carotenoides, tocoferoles, ascorbatos), mineral (Se, Zn), polifenoles y bioflavonoides. Mediante técnicas como la fotometría, fluorescencia, espectrofotometría.

La actividad enzimática de SOD, GPX, GSH, Cat.

4. TÉCNICAS DE VALORACIÓN ELECTROQUÍMICA

Son métodos muy rápidos basados en la aplicación de potenciales eléctricos sobre la muestra que permiten evaluar su comportamiento REDOX. Con ello obtenemos indicadores de comportamiento global de la muestra.

Método ORP (Oxidation Reduction Potential). Es un método potenciométrico que mide el potencial entre dos electrodos, uno de referencia y un electrodo de platino. Las reacciones de trasferencia de electrones tienen lugar en el electrodo de platino hasta que se alcanza el equilibrio de oxidación y reducción de los compuestos en solución. El resultado es un potencial medido en milivoltios que depende del potencial estándar de sustancia como ratio entre sustancias oxidadas y reducidas. Se basa en la ecuación de Nerst. Indica como la muestra se comporta como medio oxidante o reductor.

Realizar mediciones seguras de ORP en mezclas complejas, como la sangre, resulta complejo por la lenta cinética en alcanzar el equilibrio (el equilibrio redox de la sangre puede durar hasta 20 horas) y por los numerosos sistemas redox que suceden.

Método EDEL. Es un método voltamétrico de barrido lineal. Una pista secuencial de potencial es aplicada y se mide la corriente generada como respuesta. La corriente es generada por la oxidación electroquímica de la muestra en el electrodo activo, de acuerdo a la definición química de “antioxidante” (capacidad de donar electrones para neutralizar radicales libres). El resultado corresponde al poder antioxidante de la muestra. Las unidades EDEL expresan en poder antioxidante en nanowatios. Depende de la concentración de antioxidantes, su grado de difusión y sus interacciones moleculares.

El resultado EDEL tiene en cuenta la contribución de los antioxidantes mas activos y relevantes biológicamente, los de reacción rápida, en comparación con los reacción lenta. La medición se ajusta a muestras complejas, como la sangre, ya que la oxidación electroquímica forzada genera una corriente medible en 15 seg, sin necesidad de aplicar ningún pretratamiento.

5. INVENCIÓN DEL MÉTODO EDEL

La invención y desarrollo de este método ha sido realizada por Phillipe Tachinni, biólogo por la Universidad de Lausane (Suiza), doctor en bioquímica por la Universida de Stanford (USA), especialista en electroquímica, e investigador del Centro Tecnológico de Lausane, perteneciente al Instituto Suizo de Tecnología (EPFL).

En la década del 2000, el Dr. Tachinni, se encargaba de un proyecto de la OMS para la búsqueda de plantas medicinales antioxidantes en Mongolia. Se encontró con una limitación. El tiempo que transcurre desde la recolección de una planta fresca, hasta que esta es llevada a un laboratorio de análisis, hace impracticable la valoración de su poder antioxidante. Además de ello, el método generalizado para la valoración en este tipo de productos, denominado ORAC, es una técnica analítica enrevesada, larga, y con resultados discrepantes de unos centros a otros.

El método ORAC fue la técnica analítica generalizada desarrollada e implantada bajo el paraguas de la FDA (USA). Aquí surgió la idea del Dr. Tachinni de desarrollar un método que permitiera medir el poder antioxidante de un líquido in-situ y de forma rápida.

El proyecto de investigación fue apoyado por el gobierno suizo, aunque finalmente el proyecto inicial de la OMS en Mongolia no se concluyó. Este proyecto, por el contrario, sí que dio su fruto, llegando a la invención, desarrollo y lanzamiento del Método EDEL en 2009 (bajo patente nacional en Suiza).

6. DESCRIPCIÓN DE LA TECNOLOGÍA EDEL

El método EDEL, es un método único, que realiza la medición de forma directa sobre una gota de sangre (u otro fluido) mediante un proceso electroquímico. Se aplica un potencial eléctrico (voltaje) variable a la muestra que produce flujo de electrones (intensidad), y se obtiene un voltamograma.

Se corresponde con la definición de reacciones químicas redox y la de antioxidante, que se basa en la transferencia de uno o más electrones de unas especies a otras. El potencial de oxidación es aplicado a la muestra de forma global y se tienen en cuenta las interacciones moleculares entre todas las especies contenidas en la muestra. La medición esta en concordancia con la actividad biológica total de la muestra y no sobre uno de sus componentes aislados.

En el método de estudio se emplea el principio de pseudotitracion, que tiene en cuenta la mayor contribución antioxidante de reacción rápida ante un bajo potencial de oxidación, y considera en menor medida la contribución de antioxidantes lentos, que requieren un mayor potencial. Además se descarta el proceso de ionización de moléculas de agua (Electrochemical Pseudo-Titration of Water Soluble Antioxidants, Tacchini et al, Electroanalysis, 2013, 25, No 4, 922-930).

El valor EDEL expresa el poder antioxidante de una muestra compleja (sangre), y tiene utilidad como marcador general de salud o energía vital. La medición del poder antioxidante se expresa como potencia eléctrica, y se corresponde con la energía.

Del mismo modo que la producción de energía celular en forma de ATP está basada en las corrientes de electrones generadas en la mitocondria, le energía en el torrente sanguíneo se puede expresar por el potencial eléctrico que se genera por las sustancias antioxidantes. Se ha verificado que el valor obtenido en unidades EDEL, guarda correlación con el rendimiento físico, capacidad de recuperación y poder antioxidante. Por ello se puede considerar un método valido para establecer un marcador de estado vital, estado de forma y estado de recuperación.

El dispositivo EDEL-Meter. Se trata un dispositivo pequeño y portablede conexión USB que incorpora el software de presentación de datos y permite imprimir un informe de la medición.

El dispositivo EDEL-Meter Sensus Medical Systems

El sensor de medición EDEL-Strip, de un solo uso, la valoración directa sobre un fluido. Es una tira polimérica con electrodos de nanotubos de carbón y que forman una cubeta de reacción en el extremo distal. Se inserta en el dispositivo y se deposita la muestra de sangre.

El dispositivo EDEL-Meter Sensus Medical Systems

Medición y resultados. La medición se realiza en 30 segundos y el resultado se expresa en unidades EDEL. Existe un rango óptimo de unidades EDEL en sangre, que es el que se corresponde con un estado de protección antioxidante óptimo y con un valor energético del sistema sanguíneo.

Un valor bajo indica una baja disponibilidad de antioxidantes para combatir procesos oxidativos y se corresponde con un estado de baja vitalidad o merma en la capacidad de recuperación. Se corresponde a un riesgo elevado de padecer estrés oxidativo, riesgo de fatiga o cansancio, envejecimiento acelerado, aumento del riesgo de padecer lesiones y enfermedades. Un valor demasiado elevado, por encima del rango óptimo, indicaría que está sucediendo un proceso de hiper-activación, que habría que vigilar.

Aplicación práctica. Este tipo de valoración es de suma utilidad en medicina preventiva, medicina deportiva y medicina anti-envejecimiento. Es necesaria como prueba previa a la terapia con ozono. Prueba complementaria en los test genéticos y en análisis de riesgo cardiovascular. Es además un complemento muy útil en terapia de fertilidad, y de orientación en estados de lesion musculo-esquelética y dolor crónico.

Procedimiento

Método Edel Sensus Medical Systems
1. Muestra de sangre
Método Edel Sensus Medical Systems
2. Valoración
Método Edel Sensus Medical Systems
3. Resultado
Método Edel Sensus Medical Systems
4. Interpretación

7. POSICIONAMIENTO

La tecnología EDEL, constituye el primer método diseñado en el mundo para medir el poder antioxidante de una solución total, de forma inmediata, sin necesidad de adición de reactivos químicos.

El método permite valorar la muestra en el mismo instante que se precisa conocer su valor. No requiere realizar ninguna manipulación, purificación o aislamiento de componentes que desvirtúen el resultado.

Además se ajusta de la forma más fideligna al análisis antioxidante por definición. Es el sistema más rápido, económico y de fácil manejo existente en el mercado.

8. INVESTIGACIÓN Y ENSAYOS CLÍNICOS (España)

En verano 2014 comenzamos los proyectos de investigación en España con la Prof. Dra. Mónica de la Fuente, Dpto. Fisiología Animal, Universidad Complutense de Madrid. “Evaluación de la técnica EDEL frente a otros métodos de laboratorio”. Estudio de laboratorio sobre 50 muestras de plasma a las que ya se había medido la capacidad antioxidante total por técnica de reducción de Cu. El resultado proporcionó datos concluyentes de correlación para el uso de este método en la práctica clínica.

Posteriormente se ha continuado la investigación en dicha universidad. Se está valorando la sangre de ratones experimentales para relacionar con la longevidad. Se esta valorando la sangre de individuos centenarios y de pacientes de alzheimer procedente del Hospital Clínico San Carlos (Madrid). Se tendrán resultados concretos durante 2016.

9. UTILIZACIÓN CLÍNICA

  • Medicina antienvejecimiento.
  • Medicina deportiva.
  • Medicina cardiovascular.
  • Nutrición y regulación metabólica.
  • Valoración pre-terapia ozono.
  • Valoración auxiliar con test genéticos.
  • Valoración auxiliar en pruebas de fertilidad.